Projekt

Wyleczymy Neutropenię (FIXNET): wykorzystanie identyfikacji zaburzeń funkcji proteaz granulocytów obojętnochłonnych jako nowych możliwości diagnostycznych i terapeutycznych

Neutropenie u dzieci stanowią niejednorodną grupę niedoborów odporności, których wspólną cechą jest znaczne zmniejszenie liczby krążących we krwi granulocytów obojętnochłonnych, czyli neutrofili. Są one najliczniejszą grupą spośród wszystkich leukocytów, ich rolą jest wychwytywanie i niszczenie drobnoustrojów chorobotwórczych, w ten sposób biorą udział w nieswoistej odpowiedzi immunologicznej.

Obecne dianostyka neutropeni opiera się na badaniu morfologicznym krwi oraz objawach klinicnzych, takich jak nawracające infekcje i owrzodzenia błon śluzowych. Na tym etapie nie istnieje możliwość rozróżnienia przyczyn molekularnych powstawania choroby, a co za tym idzie lekarze nie wiedzą, czy dany przypadek ma charakter wrodzony czy przejściowy, wynikający z przyczyn immunologicznych, np. po przebyciu infekcji wirusowej. W każdym przypadku pediatra zmuszony jest do odroczenia szczepień ochronnych, co w konsekwencji prowadzi do ponad 3 000 przypadków nieszczepionych dzieci w Polsce rocznie. W przypadku neutropenii wrodzonej, wynikającej z określonych defektów genetycznych, istnieje konieczność opracowania szybszego i tańszego sposobu kompleksowej diagnostyki i leczenia. Obecnie, u około 30-40% pacjentów z neutropeniami wrodzonymi, nieznane są mutacje genów odpowiedzialnych za powstanie tej choroby.

Niedobory neutrofili we krwii mogą wynikać z zahamaowania ich dojrzewania, zatrzymania w szpiku kostnym lub defektów na poziomie komórki prowadzących do jej śmierci, czyli apopotozy. W neutrofilach znajdują się wyspecjalizowane ziarnistości, w których skład wchodzi wiele białek, m.in. specyficzne neutrofilowe proteazy serynowe. Proteazy te są niezbędne do dojrzewania i funkcjonowania całej komórki a mutacje w kodujących je genach często prowadzą do defektów neutrofili.

Projekt zakłada połączenie danych klinicznych i genetycznych z danymi dotyczącymi biologii neutrofilowych proteaz serynowych. Najważniejsze cele projektu to poszukiwanie nowych genów, których defekty prowadzą do wystąpienia neutropenii, identyfikacja roli proteaz w zaburzeniach funkcjonowania neutrofili, stworzenie unikalnego testu diagnostycznego oraz efektywnej i bezpiecznej metody terapii komórkowej opartej na edycji zmienionych genów.

Etap 1

Poszukiwanie pacjentów z neutropenią w celu oceny ich objawów klinicznych.

  • Rekrutacja pacjentów z neutropenią związaną z obniżoną odpornością, neutropenią wrodzoną i członkami ich rodzin.
  • Pobranie próbek krwi, moczu i szpiku kostnego od rekrutowanych pacjentów z neutropenią o różnej etologii.

ramy czasowe: 1-18 miesięcy projektu

Etap 2

Analiza genetyczna pacjentów z wrodzoną neutropenią.

  • Identyfikacja podłoża genetycznego w obrębie znanych genów związanych z neutropenią.

ramy czasowe: 6-24 miesięcy projektu
metody: sekwencjonowanie NGS

Etap 3

Analiza genetyczna całego eksomu/całego genomu pacjentów z wrodzoną neutropenią.

  • Identyfikacja przypuszczalnej przyczyny genetycznej związanej z neutropenią.

ramy czasowe: 18–48 miesięcy projektu
metody: sekwencjonowanie NGS

Etap 4

Generowanie repozytorium indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) od pacjentów z wrodzoną neutropenią.

  • Przygotowanie iPSC od pacjentów z różnymi zidentyfikowanymi mutacjami powodującymi neutropenię.

ramy czasowe: 3-18 miesięcy projektu
metody: generowanie iPSC

Etap 5

Edycja genów w celu naprawy różnych zidentyfikowanych mutacji powodujących neutropenię w ludzkich komórkach.

  • Korekta komórek za pomocą edycji genów metodą CRISPR/CAS9 od pacjentów z różnymi zidentyfikowanymi mutacjami powodującymi neutropenię i przygotowanie tych komórek do badań funkcjonalnych.

ramy czasowe: 6-36 miesięcy projektu
metody: technologia edycji genów CRISPR / Cas9

Etap 6

Zastosowanie znakowanych fluorescencyjnie sond do badania dystrybucji aktywnych neutrofilowych proteaz serynowych (NSP) w obrębie poszczególnych organelli w neutrofilach.

  • Utworzenie pierwszej subkomórkowej mapy aktywności NSP w granulocytach obojętnochłonnych od zdrowych dawców i od pacjentów z neutropenią za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

ramy czasowe: 1-48 miesięcy projektu
metody: HyCoSuL, mikroskopia konfokalna

Etap 7

Synteza i zastosowanie znakowanych metalem sond do badania aktywności NSP i ich interakcji z serpinami w neutrofilach od zdrowych dawców i pacjentów z neutropenią.

  • Opracowanie procedury chemicznej do syntezy sond o wysokiej czystości i wydajności opartych na aktywności NSP znakowanych stabilnymi izotopami metali.
  • Opracowanie zintegrowanej platformy biologiczno-chemicznej, poświęconej badaniu neutrofili, która będzie składać się z (1) sond chemicznych znakowanych metalem dla aktywnych NSP, (2) znakowanych metalem przeciwciał dla wszystkich NSP i (3) znakowanych metalem przeciwciał dla endogennych inhibitorów NSP.

ramy czasowe: 1-48 miesięcy projektu
metody: cytometria masowa

Etap 8

Analiza funkcjonalna próbek od pacjentów cierpiących na neutropenię i od osób zdrowych.

  • Funkcjonalne badania neutrofili z defektami zaobserwowanymi u co najmniej 80 osób.

ramy czasowe: 3-42 miesięcy projektu
metody: funkcjonalne badania neutrofili

Etap 9

Generowanie modelu mysiego z mutacjami w obrębie wybranych genów.

  • Przygotowanie modeli mysich z defektami genetycznymi podobnymi do tych obserwowanych u pacjentów z różnymi zidentyfikowanymi mutacjami powodującymi neutropenię.

ramy czasowe: 3-30 miesięcy projektu
metody: technologia edycji genów CRISPR / Cas9

Etap 10

Weryfikacja funkcjonalności neutrofili w zakaźnych modelach mysich in vivo.

  • Funkcjonalne badania neutrofili na modelach mysich z defektami genetycznymi podobnymi do tych obserwowanych u pacjentów z różnymi zidentyfikowanymi mutacjami powodującymi neutropenię.

ramy czasowe: 12–48 miesięcy projektu
metody: model mysi  infekcji

[bold_timeline_item_button title=”Expand” style=”” shape=”” color=”” size=”inline” url=”#” el_class=”bold_timeline_group_button”]