Wyleczymy Neutropenię

1. Poszukiwanie oraz weryfikacja zmian genetycznych prowadzących do powstania neutropenii wrodzonej poprzez sekwencjonowanie NGS (next generation sequencing) w panelu hematologicznym obejmującym najczęstsze geny związane z neutropenią lub całogenomowe sekwencjonowanie WGS (whole genome sequencing).

2. Funkcjonalna analiza neutrofili z wykorzystaniem fluorescencyjnych sond wiążących się do centrum aktywnego enzymu, w celu określenia lokalizacji proteaz serynowych oraz ich roli w rozwoju choroby.

3. Naprawa zidentyfikowanych defektów genetycznych w reprogramowanych pluripotentnych komórkach macierzystych (iPSC) oraz komórkach CD34+ pobranych od pacjentów z neutropenią wrodzoną. Edycja genów zostanie przeprowadzona metodą CRISPR/Cas9, a nastęnie zmodyfikowane komórki zostaną zróżnicowane do granulocytów i poddane analizie funkcjonalnej.

Etap 1. Poszukiwanie pacjentów z neutropenią w celu oceny ich objawów klinicznych.
Etap 2. Analiza genetyczna pacjentów z wrodzoną neutropenią.
Etap 3. Analiza genetyczna całego eksomu/całego genomu pacjentów z wrodzoną neutropenią.
Etap 4. Generowanie repozytorium indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) od pacjentów z wrodzoną neutropenią.
Etap 5. Edycja genów w celu naprawy różnych zidentyfikowanych mutacji powodujących neutropenię w ludzkich komórkach.
Etap 6. Zastosowanie znakowanych fluorescencyjnie sond do badania dystrybucji aktywnych neutrofilowych proteaz serynowych (NSP) w obrębie poszczególnych organelli w neutrofilach.
Etap 7. Synteza i zastosowanie znakowanych metalem sond do badania aktywności NSP i ich interakcji z serpinami w neutrofilach od zdrowych dawców i pacjentów z neutropenią.
Etap 8. Analiza funkcjonalna próbek od pacjentów cierpiących na neutropenię i od osób zdrowych.
Etap 9. Generowanie modelu mysiego z mutacjami w obrębie wybranych genów.
Etap 10. Weryfikacja funkcjonalności neutrofili w zakaźnych modelach mysich in vivo.

Więcej informacji

Do projektu zrekrutowani zostaną pacjenci ze zdiagnozowaną neutropenią wrodzoną wraz z członkami ich rodzin oraz pacjenci z neutropenią o podłożu immunologicznym. Pozwoli to na stworzenie rozbudowanej bazy danych, która wraz ze zgromadzonymi próbkami materiału (krew, szpik kostny, mocz) stanowić będzie swoiste repozytorium wiedzy mogące w przyszłości posłużyć do rozbudowywania projektu.

Zastosowane techniki sekwencjonowania nowej generacji oraz sekwencjonowania bezpośredniego umożliwią dokładne poznanie podłoża genetycznego neutropenii wrodzonej, jak również pozwolą na identyfikację zupełnie nowych genów mających związek z jej patogenezą i przebiegiem. Jednym z głównych założeń projektu jest wykorzystanie znakowanych sond peptydowych dedykowanych specyficznym proteazom neutrofilowym, które, w przypadku neutropenii uwarunkowanej genetycznie, charakteryzują się zmienną lokalizacją w neutrofilach. Pozwoli to na opracowanie szybkiego i niedrogiego testu diagnostycznego, umożliwiającego różnicowanie przyczyn neutropenii.

Wykorzystanie technologii CRISPR/Cas9 w korekcji hematopoetycznych komórek macierzystych CD34+ pochodzących od pacjentów, z następczym ich różnicowaniem w kierunku granulocytów obojętnochłonnych, umożliwi w przyszłości zastosowanie terapii komórkowej neutropenii wrodzonej oraz innych zaburzeń hematopoezy. Bezpieczeństwo i efektywność takiej terapii zostaną oszacowane na podstawie badań w modelach komórkowych ex vivo i modelach mysich in vivo. Wszystkie działania zastosowane w projekcie prowadzić będą do powstania nowego algorytmu diagnostycznego pacjentów z neutropenią oraz personalizacji ich leczenia.

Neutrofile stanowią najliczniejszą populację krwinek białych. Zbyt niska liczba neutrofilii we krwi często wiąże się z wysokim ryzykiem infekcji, również tych zagrażających życiu, a także nierealizowaniem szczepień ochronnych. W Polsce dotyczy to co najmniej 3000 dzieci rocznie. U części z tych dzieci mała liczba neutrofilii, czyli neutropenia, jest wynikiem choroby genetycznej. W neutrofiliach znajdują się wyspecjalizowane ziarnistości, w których skład wchodzi wiele białek, m.in. specyficzne enzymy znane jako neutrofilowe proteazy serynowe (NSP). Mutacje genów NSP często prowadzą do defektów neutrofili i choroby nazywanej neutropenią wrodzoną. NSP są zatem niezbędne do dojrzewania i funkcjonowania neutrofili. Głównym celem niniejszego projektu jest połączenie danych klinicznych i genetycznych z danymi dotyczącymi biologii NSP z wykorzystaniem wysoce selektywnych znaczników chemicznych, służących do identyfikacji roli tych białek w zaburzeniach funkcjonowania neutrofili. Starania trzech ośrodków akademickich w ramach konsorcjum FIXNET przyczynią się do osiągnięcia powyższego celu projektu. Umożliwi to opracowanie unikalnych w skali światowej metod diagnostycznych i terapeutycznych chorób związanych z dysfunkcją neutrofili.